Il museo è ubicato nel convento medievale di San Matteo, si affaccia sull'Arno con un'elegante prospetto in stile romanico pisano ed una facciata (dove si trova l'ingresso) classicheggiante. Possiede una serie completa di opere dei principali maestri pisani e più in generale toscani dal XII al XVII secolo, oltre a reperti archeologici e ceramici. Il numero e la rilevanza delle opere qui custodite fanno del San Matteo, sito forse meno noto di quanto meriterebbe, uno dei musei più importanti d'Europa in tema di arte medioevale.

Il museo attualmente è sede della raccolta artistica più ampia delle città. Conserva infatti una cospicua quantità di ceramiche medievali, costituita una ricca serie di bacini ceramici di area mediterranea e dal vasellame medievale e di età moderna proveniente da vari ritrovamenti cittadini (raccolta Tongiorgi).

Per l’oreficeria si segnalano alcuni preziosi oggetti, che si accompagnano ad una selezione di monete e di sigilli medievali (collezioni Franceschi e Supino). Di grande importanza è la sezione dedicata ai codici miniati, che conserva esemplari dal XII al XIV secolo, rimarchevoli per la ricchezza delle illustrazioni.

La collezione di scultura lapidea comprende opere dal medioevo al Cinquecento, tra cui spiccano notevoli testimonianze del periodo "romanico" e i capolavori di Nicola Pisano e Donatello. Assai nutrite e di massimo rilievo sono le raccolte di scultura in legno e di pittura: questa annovera più di 200 opere realizzate tra gli inizi del XII secolo e l’età moderna da importanti artisti tra i quali Francesco Traini, Giovanni di Nicola, Beato Angelico, Agnolo Gaddi, Luca Tommè, Domenico Veneziano, Gentile da Fabriano, Cecco di Pietro, Giunta Pisano, Berlinghiero, Simone Martini e Masaccio.