Nelle splendide sale della galleria hanno trovato posto le opere provenienti da acquisizioni, donazioni ed incameramenti dei beni degli enti religiosi soppressi (1866). Prima di questa sede le opere facevano parte della Pinacoteca della Regia Università e, dal 1866 in poi, delle collezioni del Museo Nazionale di Palermo, divenuto Museo Regionale in seguito al trasferimento delle competenze sui beni culturali dallo Stato alla Regione Siciliana, in virtù dello statuto.

Al primo piano l'opera di maggior rilievo è, senza dubbio, l'Annunziata di Antonello da Messina (XV secolo). Opera di assolutezza formale, considerata una autentica "icona" del rinascimento italiano, è collocata nella sala X conosciuta come sala dell'Antonello. La Vergine è colta nell'istante supremo dell'Annunciazione (l'angelo le sta di fronte ma è invisibile). Il gesto della mano, il trapezio del manto, la politezza delle forme e lo sguardo magnetico, esaltano la figura restituendole una astratta bellezza. Nella stessa sala, a fianco ad essa sono collocate altre opere di Antonello: le tavole con le immagini di tre Dottori della Chiesa che costituivano le cuspidi di un polittico andato disperso.

Tra gli artisti più importanti  troviamo opere di Antonello e Domenico Gagini, Francesco Laurana, Pietro Ruzzolone, Bartolomeo Camulio, Jan Gossaert, Jan Provost, Vincenzo da Pavia, Jacopo Palma il vecchio, Cavalier d'Arpino, Francesco Albani, Giorgio Vasari, Simon Vouet, Battistello Caracciolo, Antoon van Dyck, Josepe Ribera, Andrea Vaccaro, Mattia Preti, Luca Giordano.