L'interno a tre navate, coperto da capriate, è preceduto da un vestibolo con armadi lignei d'epoca, dove venivano conservati arredi liturgici e documenti. In particolare in questo ambiente fu conservato l'archivio dell'ordine quando fu trasportato da Pisa a Firenze.

Tra le opere conservate il Crocifisso sagomato con i dolenti, di Lorenzo Monaco, la Natività di Bicci di Lorenzo (1435), la tavola dell'Incoronazione della Vergine di Neri di Bicci, l'Annunciazione del Maestro di Stratonice ovvero il lucchese Michele Ciampanti del 1490 circa (tutti e quattro portati dalle cavalleresse dallo spedale di San Niccolò), l'Ultima Cena di Jacopo Palma il Giovane, la Decollazione del Battista di Pier Dandini.

Alla riconsacrazione cinquecentesca risale l'acquisto della pala d'altare della Nascita di san Giovanni Battista di Santi di Tito, terminata dal figlio Tiberio Titi (oggi nella controfacciata a destra, 1603). Due sepolcreti in marmo appartengono ai frati gerosolomitani Domenico Manzuoli e Angelo Martellini.

Il Crocifisso ligneo nella navata destra si dice che sia stato intagliato nel legno dell'albero che miracolosamente rinverdì in pieno inverno al passaggio della salma di san Zanobi durante la traslazione da San Lorenzo a Santa Reparata. Questo avvenimento miracoloso è segnalato dalla cosiddetta colonna di San Zanobi in piazza San Giovanni.