L'interno del duomo è a tre navate. La navata centrale è rivestita di marmo. Le colonne che dividono le navate sono sormontate da finti matronei. I capitelli delle colonne che dividono le navate risalgono all'inizio del Trecento; si tratta pertanto di colonne, nel primo ordine, di epoca gotica, più recenti delle arcate del falso matroneo da esse sorrette, che risulta invece appartenente alla costruzione romanica (XI-XII secolo). Infatti le colonne dell'ordine inferiore e le soprastanti arcate a fasce bianche e nere rappresentano una sostituzione delle precedenti colonne ed arcate romaniche a seguito di una devastazione e incendio avvenuta durante le lotte tra le fazioni. Per sostituirle lasciando intatta la parte superiore si crearono adeguate strutture di carpenteria in legno, la realizzazione delle quali era agevolata anche dalla grande esperienza in materia che veniva dalla cantieristica navale consona alle attività portuali. Si poté così cambiare le colonne inferiori lasciando intatte le arcate romaniche del soprastante matroneo.

Sopra la porta mediana ci sono due affreschi dipinti tra la fine del XIII secolo e l'inizio del XIV che raffigurano il Giudizio universale e la Glorificazione della Vergine. Sono in stile bizantino e si richiamano agli stili di Costantinopoli dei quel periodo.

Molte le opere conservate all'interno di: Luca Cambiaso, Federico Barocci, Gio Ansaldo, Lazzaro Tavarone, Gaetano Previati, Domenico Gagini, Matteo Civitali, Andrea Sansovino, Giacomo e Guglielmo Della Porta, Taddeo Carlone e altri.

Lungo la navata sinistra si trova la cappella di San Giovanni Battista costruita tra negli anni tra il 1450 e il 1465. In fondo alla navata destra si accede al museo del tesoro di San Lorenzo, capolavoro di Franco Albini, terminato nel 1956. Qui si possono ammirare oggetti sacri preziosi, tra cui il cosiddetto Sacro Catino (manufatto di arte vetraria di fattura islamica del IX-X sec.).