La basilica venne edificata intorno al 996 sopra la precedente cattedrale, la prima sede vescovile di Perugia, esistente sin dal VII secolo, anche se i primi documenti che citano la chiesa sono del 1002. Il primo abate fu Pietro Vincioli, un nobile perugino, successivamente canonizzato.

L'interno con struttura basilicale a tre navate, ospita la più grande collezione di arte di Perugia, dopo la Galleria Nazionale dell'Umbria. La navata è articolata da arcate su colonne in marmo antico grigio, probabilmente provenienti da costruzioni romane. La parte alta è decorata da tele dipinte con scene dal Vecchio e Nuovo Testamento, commissionate dall'abate Giacomo da San Felice di Salò e completate nel 1591-1611. Vennero realizzate a Venezia da Antonio Vassillachi, artista formatosi alla scuola di Paolo Veronese e del Tintoretto. Sempre di Vassillachi è la grande tela collocata nel muro ad ovest, il Trionfo dell'ordine dei Benedettini. La navata centrale ha un soffitto a cassettoni in legno riccamente decorato da Benedetto di Giovanni da Montepulciano nel 1556.

Le altre opere d'arte includono lavori di Ventura Salimbeni, Eusebio da San Giorgio, Orazio Alfani, copie del Perugino, Girolamo Danti (sagrestia, 1574), Giovanni Lanfranco, Mino da Fiesole (un marmo con Gesù da giovane, San Giovanni Battista e San Ieronimo, nella Cappella Vibi), un Gesù nell'Orto attribuito a Guido Reni, Giuditta e Oloferne di Sassoferrato, Gesù Bambino e San Giovannino di Raffaello, un San Paolo e un San Pietro di Guercino, Cristo nell'orto con l'angelo di Carracci, tre grandi quadri di Giorgio Vasari, la Sacra Famiglia del Parmigianino, Santa Romana e l'angelo di Giovanni Antonio Galli ed una Pietà della scuola di Sebastiano del Piombo. Del Perugino c'è una serie di santi nella sagrestia, un tempo parte del complesso dell'Ascensione (1496), che decorava l'altare principale della chiesa, tela requisita nel 1796 ad opera di Giacomo Tinet, commissario legato al seguito delle truppe napoleoniche (oggi è esposta al Museo di Lione).

La principale caratteristica del presbiterio (ricostruito dal Martelli e decorato con opere d'arte della fine del XVI secolo) è l'intarsio del coro ligneo, considerato uno dei più belli d'Italia. Fu iniziato da Bernardino di Luca Antonini nel 1525-26, e completato da Stefano di Antoniolo Zambelli, da Bergamo, nel 1535. Di particolare valore è la porta centrale, con un rilievo raffigurante l'Annunciazione e Mosè salvato dalle acque di Fra Damiano da Bergamo (1536).

L'abbazia ha due altri chiostri: uno, chiamato Chiostro Maggiore, è una costruzione rinascimentale attribuita a Guido da Settignano, l'altro, conosciuto anche come Chiostro delle Stelle, è del 1571 ed è dovuto a Galeazzo Alessi.