La Pinacoteca Nazionale è ospitata a Palazzo dei Diamanti, con dipinti fondamentali della scuola ferrarese dal medioevo al XVIII secolo.

Le pitture più antiche sono grandi affreschi staccati (Trionfo di sant'Agostino di Serafino da Modena) o tavole a fondo oro, come la Madonna col Bambino di Gentile da Fabriano. Cosmè Tura (presente con il Giudizio e il Martirio di san Maurelio), Ercole de' Roberti, Vicino da Ferrara e Michele Pannonio sono i principali artisti ferraresi del Quattrocento, rappresentato da varie opere. Dalle collezioni estensi provengono opere di vari artisti, tra cui Andrea Mantegna (Cristo con l'animula della Madonna). Di autore incerto sono la Musa Erato e la Musa Urania, che provengono dallo Studiolo di Belfiore del marchese Leonello d'Este a palazzo di Belfiore.

Il Cinquecento è rappresentato dal maestro del classicismo Garofalo, presente con numerose opere tra le quali spicca la Pala Costabili, opera di collaborazione con Dosso Dossi. Il periodo del manierismo è testimoniato dalle opere del Bastianino, caratterizzate da una fisicità derivata dalle opere di Michelangelo, che si rarefà nelle più eteree opere tarde. altri maestri presenti con loro opere sono Vittore Carpaccio, l'Ortolano, il Manieri, il Panetti, il Coltellini, il Maestro degli Occhi Spalancati e altri.

Tra le opere più importanti del Seicento va menzionato il Martirio di San Maurelio (1635) del Guercino.

Nelle collezioni delle pinacoteca sono molto rare le opere di pittori non italiani. Di particolare interesse è il ritratto di Famiglia del 1801 di François-Guillaume Ménageot.