Venne fondata da Federico Borromeo nel 1618 nei pressi della Biblioteca Ambrosiana, istituita già nel 1609. L'istituzione nacque per assicurare una formazione culturale gratuita a chiunque avesse qualità artistiche o intellettuali. Alla Pinacoteca fu infatti affiancata, fin dal 1621, un'accademia di pittura e scultura, con calchi in gesso del Laocoonte e della Pietà di Michelangelo provenienti dalla raccolta di Leone Leoni. Il primo docente di pittura fu il Cerano; unico allievo di una certa importanza fu Daniele Crespi.

Nella Pinacoteca si possono trovare oggi opere, provenienti dalla collezione di Federico Borromeo (nei quattro corridoi che circondano la sala di lettura della Biblioteca) e da numerosi lasciti successivi, tra cui dipinti di Marco d'Oggiono, Leonardo, Botticelli, Bramantino, Bergognone, Bernardino Luini, Tiziano, Jacopo Bassano, Moretto, Caravaggio, Morazzone, Daniele Crespi, Andrea Appiani, Francesco Hayez.

Interessante dal punto di vista storico è la produzione di copie da dipinti celebri, promossa da Federico Borromeo per scopi didattici e documentativi, come la replica dell'Ultima Cena di Leonardo, che già nel XVII secolo era in condizioni assai precarie. La copia è stata realizzata da Andrea Bianchi.