Il Museo è sito nel trecentesco Palazzo Neri Orselli. La configurazione attuale dell'edificio è frutto di accorpamenti di strutture preesistenti, ampliamenti e lunghi di lavori di restauro che l'hanno coinvolto nel corso dei secoli senza intaccarne la struttura originaria. L'allestimento e il percorso museale seguono un percorso tematico suddiviso nelle quattro sezioni principali.

La prima sezione è dedicata alla Collezione Poliziana. Vi fanno parte materiali lapidei, ceramiche e metalli. Tra essi, un Marzocco del XVI secolo e gli Stemmi delle famiglie Cocconi e Cervini. Tra le ceramiche, oggetti di uso quotidiano e domestico ritrovate nel pozzo ancora presente nei sotterranei del palazzo e databili tra il XIII e il XV secolo.

La sezione archeologica ospita corredi funerari etruschi databili tra il VI e il IV secolo a.C., urne cinerarie, candelieri e oggetti di uso quotidiano etruschi e romani.

La Pinacoteca, intitolata a Primicerio Francesco Crociani, che al museo lasciò la sua collezione, ospita opere di artisti senesi: una Crocifissione di Luca di Tommé, l'Incoronazione della Vergine di Angelo Puccinelli, una Madonna col Bambino e San Giovannino attribuita al Pinturicchio.

Troviamo anche una ricca collezione di Corali miniati trecenteschi e la Sacra Famiglia con San Giovannino di Antonio Bazzi detto il Sodoma. Notevole è poi la galleria dei Ritratti di Santi di Tito, Spagnoletto ed altri. Una speciale sezione è dedicata alle terrecotte di Andrea della Robbia tra cui il San Giovanni Battista e un busto raffigurante il Redentore di Giovanni della Robbia.