Nella Sede centrale in piazza del Duomo a Firenze si custodiscono, oltre all'Archivio storico, alcune opere d'arte e una collezione di materiale storico e oggetti della tradizione della Confraternita, organizzata in un museo situato al quarto piano dell'edificio.

Nel percorso museale, che si snoda in 14 sale, sono racchiuse le testimonianze di oltre sette secoli di attività, di committenze artistiche, di lasciti e donazioni, segno tangibile della gratitudine del popolo fiorentino verso l’Istituzione, fino ad ora solo parzialmente visibili al pubblico, perché conservate in uffici e archivi della Misericordia di Firenze.

Si tratta di una ricca esposizione che racchiude circa ottanta pezzi, molti dei quali appositamente restaurati per il Museo, tra manoscritti, quadri, stemmi, arredi, oggetti d’uso e manufatti dell’artigianato fiorentino; oltre ad una copia del 1500 dello Statuto dell’Arciconfraternita.

E’ possibile ammirare opere di pregio realizzate da importanti autori come Santi di Tito, Benedetto da Maiano, Sano di Pietro, Bacchiacca, Sogliani, G. Battista Naldini, Butteri, Dono Doni, Puligo, Carlo Dolci e tele del periodo caravaggesco e di quello contemporaneo con Annigoni e Chaplin.