L'interno è caratterizzato dalla compresenza di vari stili architettonici, legati agli interventi susseguitesi nel corso del tempo: della costruzione duecentesca rimane la torre campanaria e la pianta basilicale a tre navate, mentre la copertura "a carena di nave" è di impronta gotica e le decorazioni dell'altare maggiore e della navata centrale sono lombardesche. In particolare, il soffitto utilizza le tecniche di costruzione navali tipiche dell'Arsenale di Venezia.

Alla parete dell'ingresso si trova l'organo con tre dipinti cinquecenteschi attribuibili ad Andrea Schiavone, la Disputa di Gesù, la Chiamata degli Apostoli e il Martirio di San Giacomo, più altri due dipinti dello stesso autore ai lati della porta raffiguranti i Profeti. Dopo la Sacrestia Nuova, si trova la Cappella del Sacramento, risalente alla seconda metà del XVI secolo e successivamente ristrutturata nel 1753, nella quale si trovano dipinti di Alessandro Varotari (Gli Evangelisti), Tizianello (La flagellazione), Giulio Del Moro (Ecce Homo) e Jacopo Palma il Giovane (La salita al Calvario e La deposizione nel Sepolcro). Gli affreschi della cupola, ornata con decorazioni a stucco, risalgono alla ristrutturazione settecentesca e sono attribuiti a Jacopo Guarana.

La pala dell'altare maggiore raffigurante La Vergine col Putto fra i Santi Andrea, Giacomo, Cosma e Damiano, più nota come Pala di San Giacomo dell'Orio, è opera di Lorenzo Lotto, eseguita nel 1546. Nella cappella dell'abside si trovano altri dipinti di scuola veneziana e il dipinto su tela L'Addolorata di Lorenzo Gramiccia.

Le opere più importanti sono conservate nelle sacrestie, in particolare nella Sacrestia Nuova a lato del presbiterio sono conservate opere di Paolo Veronese: Allegoria della Fede, al centro del soffitto, i Quattro Dottori della Chiesa ai lati e la pala San Lorenzo, San Giuliano e San Prospero, datata 1573 e originariamente usata come pala per l'altare della cappella di San Lorenzo. Sovrasta la porta della sacrestia il quadro San Sebastiano fra San Rocco e San Lorenzo di Giovanni Buonconsiglio, opera eseguita tra il 1498 e il 1500 che in precedenza ornava l'altare della chiesa di San Sebastiano. Sono presenti infine due tele di Francesco Da Ponte, La predicazione del Battista e La Vergine in gloria con San Giovanni e San Nicolò, una Cena di Emmaus del primo Cinquecento e una piccola Crocifissione di Palma il Giovane e un intaglio in legno dorato su fondo blu anch'esso risalente al primo Cinquecento. Completa la decorazione della sacrestia, sopra all'ingresso esterno, un altro quadro della scuola del Veronese raffigurante L'ultima cena.