La raccolta museale allestita su diversi piani, illustra la storia e la cultura locale dalla preistoria al XX sec. Di assoluto rilievo e fama internazionale sono le Tavole iguvine, sette lastre di bronzo su cui è iscritto il più importante testo in lingua umbra e la più estesa descrizione di riti religiosi che il mondo occidentale antico abbia mai restituito. Le Tavole rappresentano il cuore di una collezione archeologica tra le più ricche dell'Umbria con reperti risalenti all'epoca umbra e romana.

La raccolta numismatica si compone di importanti esemplari italici e romani in bronzo, monete medievali, ducali e papali, quest'ultime coniate dalla zecca di Gubbio.

Allestita nella sala della loggetta e lungo il corridoio segreto, la raccolta di ceramica spazia dalle maioliche arcaiche (XIV sec.) ai manufatti del XIX sec. Di particolare rilievo è la produzione eugubina rinascimentale a lustro rosso e dorato della bottega di Mastro Giorgio Andreoli (XVI sec.) Numericamente significativo è il vasellame farmaceutico tra cui originali duomi d'alambicco in terracotta rossa.

Le sale del piano nobile ospitano la pinacoteca ricca di dipinti su tavola e tela principalmente di scuola umbra, databili dal tardo Duecento all'Ottocento.

Degni di nota sono il Reliquiario miniato (XIV sec.), il Crocifisso ligneo di scuola giottesca opera del Maestro della Croce di Gubbio (inizio XIV sec.), il Gonfalone (inizio XVi sec.) realizato da Sinibaldo Ibi, artista seguace del Perugino e l'Immacolata Concezione di Francesco Signorelli (1527).