Il museo ha sede nelle cantine sotterranee della villa di Poggio Reale, situata sulla sommità di un colle a poche centinaia di metri dal centro del capoluogo. Gli oggetti esposti sono in genere quelli utilizzati per la coltivazione della vite e per la produzione e la conservazione del vino in uso nei decenni della prima metà del secolo scorso.

Sono da segnalare un enorme tino in legno per la fermentazione dell'uva appena raccolta, i vari strumenti usati nella vigna, le molteplici tecniche di potatura e legatura. Una parete è totalmente tappezzata di fiaschi di vino, da quello settecentesco soffiato a bocca agli ultimi stampati in milioni di esemplari tutti uguali e rivestiti con la malinconica plastica. L'ultima sala è dedicata al commercio, alla spedizione e al consumo del prezioso "nettare" e, nel mezzo, imponente, spicca il carro, un tempo trainato da una pariglia di cavalli, sul quale venivano sapientemente collocate varie centinaia di fiaschi, uno sull'altro a piramide, che dovevano affrontare il viaggio di circa trenta chilometri che separano Rufina da Firenze.

La struttura museale è completata da una biblioteca che conserva una vasta letteratura di argomento enologico (compresa una copia del famoso bando granducale del 1716 nel quale venivano precisati i confini delle quattro zone della Toscana considerate a genuina vocazione vinicola) e da una ricca enoteca dove sono ospitati e conservati (ma anche bevuti) i vini di maggior prestigio prodotti in loco.