Il museo si sviluppa su due piani, con una presentazione topografica (al pian terreno) e tematica (al secondo piano, dove si trovano gli oggetti di paleontologia, preistoria, numismatica e le collezioni private donate da alcuni cittadini aretini).

Il pian terreno è dedicato all'arte etrusca e romana, con la prime due sale che espongono i reperti di Arezzo e la sua area, dall'epoca villanoviana all'ellenismo. Tra i pezzi più pregiati spiccano i gioelli dalla necropoli di Poggio del Sole, un frontone scolpito e policromato con scene di combattimento (480 a.C.) e una serie di ritratti votivi, rinvenuti in via della Società Operaia e databili tra il II e il I secolo a.C.

Nella terza sala si trova l'opera più importante del museo, un cratere attico a volute a figure rosse con l'Amazzonomachia, attribuito a Euphronios (510-500 a.C.). Le due sale successive presentano i reperti dalla Val di Chiana e dal Casentino, tra iq auli spiccano un torso maschile in pietra fetida (fine del VI secolo a.C.) e l'anfora attica a figure rosse con il Rapimento di Ippodamia della scuola del pittore di Meidias (410-400 a.C.)

La quattro sale seguenti sono dedicate alla terra sigillata, produzione ceramica sviluppatasi tra il I secolo a.C. e il I secolo d.C. che ebbe in Arezzo il centro di produzione più importante del Mediterraneo per circa un secolo.

Le ultime sette sale sono dedicate all'epoca romana, con ritratti e statuaria, mosaici, corredi funebri e oggetti in bronzo. Interessanti sono un ritratto di Livia, una testa fittile ellenistica, forse un'amazzone, proveniente dal frontone di un tempio e la testa di un giovane in terracotta.

Al primo piano sono custoditi gli oggetti di arte applicata e di uso quotidiano. Di grande pregio è il ritratto virile in oro su vetro del III d.C., tra i più raffinati esempi di questa tecnica. Tra le ceramiche spicca la collezione di buccheri del VI secolo a.C. Un'intera sala è dedicata alla numismatica, dove è particolarmente raro il grande quinipodium, del quale si conosce solo un altro esemplare al mondo.