La costruzione della chiesa e dell'attiguo convento fu iniziata dagli Agostiniani a partire dal 1258 e si protrasse per oltre cinquant'anni, subendo nel corso dei secoli ampliamenti e risistemazioni, soprattutto nel corso del Quattrocento, tra il 1450 e il 1490. In seguito a un rovinoso incendio nel 1747 richiese un completo rinnovo, che venne curato da Luigi Vanvitelli, dal 17 luglio 1747 al 1755.

Ricchissimo il patrimonio artistico conservato nella chiesa. Nei quattro altari di sinistra della navata troviamo: l'Adorazione dei pastori di Giovanni Francesco Romanelli (1640 circa); l'Immacolata Concezione di Carlo Maratta (1681); il Battesimo di Costantino di Francesco Vanni (1586); la pala con la Trinità e santi di Pietro Sorri (prima metà del 1600); Nei quattro altari di destra troviamo: la Comunione di san Girolamo di Astolfo Petrazzi (1631); la tavola con la Crocifissione del Perugino (1502-1504); la pala con l'Andata al Calvario, Alessandro Casolani e Ventura Salimbeni (1590-1612).

Nella cappella in fondo a destra sono stati recentemente messi in luce importantissimi affreschi risalenti al Quattrocento, prima del rinnovamento vanvitelliano del Settecento. Si tratta di due Sibille affrescate da Luca Signorelli nelle lunette della volta e di due affreschi monocromo raffiguranti la Nascita della Vergine e la Natività di Gesù, di Francesco di Giorgio Martini e bottega, forse con la collaborazione di Pietro degli Orioli. La stessa cappella ha un pavimento maiolicato del 1488.

Da una porta posta sulla parete destra della navata si accede alla celebre Cappella Piccolomini, così chiamata per la completa ristrutturazione della cappella preesistente voluto dall'omonima famiglia alla fine del XVI secolo. Vi si accede transitando da un vano dove è esposto il monumento marmoreo a Papa Pio II scolpito da Giovanni Duprè nel 1850. La cappella mostra l'altare Piccolomini, in marmi policromi, fatto erigere nel 1596, che racchiude il dipinto su tavola del Sodoma con l'Adorazione dei Magi.

Sulla parete opposta è visibile in una lunetta il celebre affresco raffigurante la Maestà di Ambrogio Lorenzetti, databile al 1337-1338. L'affresco, che è anche l'opera più antica conservata in chiesa, si salvò solo perché il progetto di trasformazione operato dalla famiglia Piccolomini portò ad addossare il poderoso altare contro la parete della Maestà del Lorenzetti. Venendo quest'ultima oscurata dall'altare, nessuno si curò di eliminarla, a differenza di altri affreschi che presumibilmente erano presenti nella cappella e che risultano oggi irrimediabilmente perduti. L'affresco fu riscoperto nel 1944, quando si volle mettere la tavola del Sodoma al sicuro dai bombardamenti della Seconda Guerra Mondiale. L'intero altare Piccolomini venne quindi spostato sul lato opposto della Cappella, dove si trova ancora oggi, permettendo alla Maestà del Lorenzetti di tornare alla luce.