L'interno è uno dei più riusciti esempi di architettura francescana a navata unica umbro-toscana, con capriate lignee a vista. La navata, larga 18 metri, in prossimità del transetto si allarga fino a 22 metri; dimensioni che la pongono come la più ampia navata tra le chiese toscane insieme a quella della basilica di San Francesco a Siena, che deriva direttamente dal modello pisano.

Gli altari realizzati durante la Controriforma ospitano tele e tavole di grande formato dei migliori artisti toscani dell'epoca: la Natività di Gesù con Adorazione dei pastori del Cigoli, l'Assunzione della Vergine di Ventura Salimbeni, il Battesimo di Cristo dell'Empoli, San Francesco riceve le stigmate di Santi di Tito, San Francesco riceve l'indulgenza di Francesco Vanni.

Notevoli sono le sepolture ospitate dalla chiesa, tra le quali quella del conte Ugolino della Gherardesca, qui sepolto con i propri figli e nipoti una volta che le spoglie di questi sventurati furono rimosse dalla non lontana torre della fame (o della muda) dove si consumò secondo Dante il "fiero pasto". In origine la tomba di Ugolino era nel chiostro della chiesa in quanto, morendo da traditore, non poteva essere posto assieme alle ossa dei propri familiari nella monumentale tomba, scolpita da Lupo di Francesco, che si trovava all'interno della chiesa. Successivamente, sia perché tale monumentale tomba fu smembrata e spostata in vari luoghi, sia per una successiva rivalutazione del Conte Ugolino, agli inizi del XX secolo i supposti resti di Ugolino, figli e nipoti vennero spostate nell'attuale cappella all'interno della chiesa.

Nella sagrestia, affreschi di Taddeo di Bartolo (1397, ripristinati nell'Ottocento da Guglielmo Botti) con Storie mariane; nella sala del Capitolo, affreschi staccati con Storie cristologiche di Niccolò di Pietro Gerini (1392) e sinopie. Pur in stato di conservazione non ottimale sono entrambe, specie i dipinti della sala capitolare, opere di grande forza espressiva e di notevole perizia esecutiva.