Costruita nei primi decenni del IV secolo (325-326?), sorge su preesistenti architetture romane variamente stratificate adiacenti alla recinzione esterna del Circo Massimo (tabernae e costruzioni private che sorgevano lungo una strada alle pendici sudoccidentali del Palatino). In seguito fu dedicata a sant'Anastasia di Sirmio (281-304), donna romana, martire sotto Diocleziano. Già negli atti del sinodo del 499 la chiesa risulta registrata con il titulus Anastasiae. La Basilica è collegata dalla tradizione alla predicazione di san Girolamo (IV sec.), che probabilmente vi ha risieduto e portato dalla Terra Santa importanti reliquie, ancora custodite, e di san Leone Magno (V sec.).

Qui è conservata la tela di Pier Francesco Mola con San Giovanni Battista nel deserto del 1658 circa. La chiesa conserva al suo interno una gran quantità di tele di Lazzaro Baldi (e collaboratori) ed uno splendido dipinto di Francesco Trevisani raffigurante san Turibio. Nel transetto di sinistra si trova la tomba monumentale del filologo e cardinale Angelo Mai, opera dello scultore neoclassico Giovanni Maria Benzoni.