L'attuale chiesa di S. Agnese è il frutto di una serie di trasformazioni e restauri, succedutisi nei secoli, di una basilica fatta realizzare da papa Onorio I (625-638), di cui ancora oggi conserva gran parte dei caratteri.

L'interno è preceduto da un nartece, dove si conservano la lastra marmorea con l'iscrizione originaria di papa Damaso dedicata alla martire sant'Agnese, ed un pluteo marmoreo, risalente alla prima sistemazione della tomba della martire ad opera di papa Liberio (352-356), che reca al centro la figura della martire avvolta in una dalmatica.

L'interno della basilica è a tre navate con tre cappelle per lato, sormontate da un matroneo. Le arcate delle navate laterali e del matroneo sono sostenute da colonne di spoglio per lo più di epoca romana, con raffinati capitelli corinzi. Tutta la decorazione interna delle navate è opera ottocentesca fatta eseguire da Pio IX e realizzata da A. Busiri Vici: in particolare si distinguono i ritratti dei pontefici benefattori della chiesa, e di sante martiri. Queste pitture hanno completamente cancellato i precedenti affreschi medievali. Il soffitto è a cassettoni, di legno intagliato e dorato, realizzato nel 1606 e restaurato nel 1855. Dalla basilica si accede alla cripta, all'annesso monastero ed alla catacomba sottostante.