L'interno è del tipo Hallenkirche (chiesa a sala), per una lunghezza di 68 metri, con tre navate di pari altezza (24,9 m); la navata centrale è larga due volte e mezza le laterali. Sulla parete di controfacciata, sopra il portale, è situata una tela di Giovanni Antonio Scaramuccia del 1616 raffigurante la Vergine fra i patroni della città e i santi Agostino, Domenico e Francesco. Alla sinistra del portale d'ingresso si trova un sarcofago del 1451 del vescovo Giovanni Andrea Baglioni, attribuito ad Urbano da Cortona.

Sulla navata sinistra si trova la cappella di San Giuseppe, dedicata al Sacro Anello, la reliquia dell'anello nuziale della Vergine Maria, una pietra verde di calcedonio od onice che venne presa furtivamente a Chiusi dal frate tedesco Winter di Magonza, e donata al vescovo di Perugia nel 1473. Protetta da una cancellata in ferro battuto del 1496-1511 opera di Bernardino e Giacomo di Matteo, la preziosa reliquia, protetta da ben quattordici serrature, viene esposta al pubblico due volte all'anno, in settembre e luglio. Sulla pietra del parapetto della cancellata è incisa la scritta: HAC SACER INTACTAE MATRIS SITUS ANNULUS AEDE QUI DEDIT EST CUSTOS MUNERIS ILLE SUI. La cappella era un tempo decorata da affreschi del Pinturicchio e da un quadro del Perugino, lo Sposalizio della Vergine, sottratto durante l'occupazione napoleonica ed oggi al museo di Caen. Il quadro fu sostituito nel 1825 da una tela di Jean Baptiste Wicar. Nella cappella è inoltre conservato il Reliquario del Sant'Anello, realizzato da Bino di Pietro e Federico e Cesarino del Roscetto, considerato tra i capolavori dell'arte orafa del Rinascimento italiano.

Di notevole pregio è l'abside, con uno splendido coro ligneo intarsiato da Giuliano da Maiano e Domenico del Tasso (1486-91), danneggiato da un incendio nel 1985. Nel transetto destro si trovava una pala d'altare di Luca Signorelli, la Pala di Sant'Onofrio, oggi conservata nell'annesso Museo dell'Opera del Duomo.

Sulla navata destra si trova la Cappella del Sacramento, realizzata da Galeazzo Alessi nel 1576, con una pala d'altare raffigurante la Pentecoste di Cesare Nebbia del 1563, il monumento funebre di papa Martino IV, deceduto a Perugia nel 1285, e reliquie di Innocenzo III e Urbano IV. La successiva rientranza conduce alla Cappella del Battistero, decorata da una vista prospettica rinascimentale in marmo di Pietro di Paolo di Andrea da Como (1477). Di fronte ad essa si trova la venerata immagine della Madonna delle Grazie, realizzata da Giannicola di Paolo, un seguace del Perugino. La navata destra termina con la Cappella di San Bernardino, chiusa da un'inferriata del XV secolo. Il suo altare ospita la più importante opera conservata nel duomo, la Deposizione dalla croce di Federico Barocci realizzata tra il 1567 ed il 1569. La tela è considerata tra i capolavori della pittura europea del XVI secolo, ed è l'unica opera del pittore urbinate rimasta in città.