Il museo venne fondato da Pio IX nel 1854, due anni dopo l’istituzione della Commissione di Archeologia Sacra, che aveva il compito di dirigere gli scavi nelle catacombe e tutelarne la conservazione; il museo doveva ospitare quei reperti la cui conservazione in loco era impossibile. Esso venne allestito a cura di Giuseppe Marchi e Giovanni Battista de Rossi.

Il museo è composto di due grandi sezioni:

-  la sezione che comprende i monumenti architettonici, scultorei e musivi; in essa si distingue in modo particolare la raccolta dei sarcofagi.

-  la sezione che raccoglie materiale epigrafico, suddiviso per età e soggetti; a causa del suo carattere specialistico, questa sezione è aperta solo agli studiosi, su richiesta.