Le collezioni comprendono innanzitutto un'interessante raccolta archeologica con reperti preistorici, resti etruschi e romani. In particolare al piano terra sono presenti resti etruschi provenienti da una necropoli limitrofa al centro rinvenuti nel 1982 e resti romani rinvenuti nelle abitazioni lucchesi.

Il Museo presenta poi collezioni che ripercorrono il percorso storico-artistico di Lucca, in particolare artisti lucchesi o stranieri operanti a Lucca dal Medioevo al Settecento, raccogliendo dipinti, sculture, arredi sacri e tessuti sia di origine laica che religiosa. Ai piani superiori si possono ammirare:

- Sant'Ansano, 1406-1413, terracotta di Jacopo della Quercia
- Croce dipinta di Berlinghiero Berlinghieri
- due Madonne col Bambino da due tabernacoli lucchesi attribuite a Donatello
- Pietà di Matteo Civitali
- Il Sant'Eustachio e il San Biagio di Giorgio Vasari
- La Crocifissione fra i santi Caterina e Giulio di Guido Reni
- San Sebastiano e San Rocco di Bernardo Parentino
- Dio Padre in gloria tra le sante Maria Maddalena e Caterina da Siena di Fra Bartolomeo e Mariotto Albertinelli del 1508
- Madonna della Misericordia di Fra Bartolomeo, anticamente posta nella chiesa di San Romano
- Madonna con Bambino e santi di Amico Aspertini
- Estasi di santa Caterina da Siena di Pompeo Batoni del 1743

Il Museo conserva una collezione di strumenti ed apparati medicali provenienti dall'antico ospedale di San Luca e alcuni strumenti di misura del Settecento e Ottocento.