Inizialmente voluto dal Beato Ildefonso Schuster, Cardinale ed Arcivescovo di Milano, trova la sua prima pietra nella lettera "Per l'arte sacra e per un museo diocesano" del 1931. Il Museo diocesano di Milano, inaugurato dal cardinale Carlo Maria Martini, arcivescovo di Milano (1979 - 2002), il 7 dicembre 2001, è situato presso i Chiostri di Sant'Eustorgio, parte dell'antico convento domenicano, restituito alla città, dopo un lungo periodo di restauro dovuto ai bombardamenti della seconda guerra mondiale. Interprete appassionato dalla volontà dell'Arcivescovo Mons.Luigi Crivelli (1933-2007), primo indimenticabile presidente della Fondazione Sant'Ambrogio, organismo di gestione del museo.

In continuo e dinamico arricchimento, le collezioni sono attualmente allestite lungo i tre corpi restaurati del secondo chiostro di Sant’Eustorgio. Fra le opere al Museo Diocesano spiccano la Caduta di San Paolo del Cerano, la Lotta di Giacobbe e l’angelo, capolavoro del Morazzone e il San Giuseppe col Bambino di Guido Reni. Inoltre opere di Bernardino Luini, Francesco Hayez, Alessandro Magnasco, Bernardino Campi, Marco d'Oggiono, del Bergognone e molti altri.

La raccolta di 41 fondi oro, eseguite tra il XIV ed il XV secolo, per la gran parte di ambito toscano ed umbro, donati dal collezionista Alberto Crespi, rappresenta un unicum nel panorama museale milanese. In questa sezione sono esposte tavole di Bernardo Daddi, Gherardo Starnina e Sano di Pietro.

Al piano terra, un'intera sezione del Museo è dedicata a opere scultoree di Lucio Fontana. Tra di esse spiccano, oltre ai gessi preparatori della quinta porta del Duomo di Milano e della Pala della Vergine Assunta, le quattordici stazioni della Via Crucis (Via Crucis bianca, 1955), in deposito al Museo dalla Regione Lombardia.