L'opera più pregevole conservata nel museo è la Crux veliterna, una stauroteca in oro filigranato, pietre preziose e smalti, opera di oreficeria palermitana risalente all'XI o al XII secolo. Questa croce, contenente secondo la tradizione un frammento della Croce di Cristo, venne donata da Federico II di Svevia a Rinaldo dei signori di Ienne, allora vescovo di Velletri e in seguito eletto papa con il nome di Alessandro IV, il quale a sua volta la donò alla cattedrale di Velletri.

Tra le altre opere artistiche conservate nel museo, una Madonna con Bambino e due angeli di Gentile da Fabriano, unica opera del suo soggiorno romano tra il 1426 ed il 1427. In origine nella basilica dei Santi Cosma e Damiano di Roma, fu trasferita nella chiesa veliterna di Sant'Apollonia nel 1633, dove rimase fino al 1913, quando venne collocata nel museo. Il restauro del 1912 ha permesso di recuperare l'originaria forma a cuspide della tavola.

Inoltre, vi è una Madonna del Rosario con i santi Domenico, Caterina da Siena e Giovanni Battista opera del pittore di scuola napoletana Sebastiano Conca. Questo dipinto, uno dei pezzi più importanti della collezione del museo, venne commissionato dalla famiglia veliterna dei Fiscari e fatto collocare nella cappella del Rosario della cattedrale di San Clemente su richiesta del cardinale Tommaso Ruffo, vescovo di Velletri tra il 1740 e il 1753.