Il museo ha sede nella torre della abbazia in una grande sala che era occupata dalla stamperia e conserva e espone dipinti, suppellettili liturgiche e oggetti legati alla storia della Congregazione Vallombrosana. Nell'abbazia di Vallombrosa, alla fine del Settecento, esisteva un museo che conservava una raccolta eterogenea di opere d'arte, reperti archeologici, naturalistici. Questo antico museo fu chiuso nel 1810 in seguito alla soppressione napoleonica.

Di particolare rilievo la pala raffigurante la Madonna col Bambino e Santi di Domenico Ghirlandaio e il parato Altoviti, che comprende una pianeta del Quattrocento. Si segnalano inoltre il bastone trecentesco in avorio con leoni intagliati, il reliquiario del braccio di San Giovanni Gualberto, numerose opere in scagliola eseguite dal monaco Ignazio Hugford (1696-1791).