Il museo è ospitato in 25 sale attigue al chiostro, accanto alla Cattedrale di San Lorenzo, al piano terra ed al piano inferiore, in alcuni locali della cripta. Le opere esposte vanno dall'alto Medioevo al XIX secolo. Il Museo conserva una importante raccolta di manoscritti che coprono un arco temporale compreso tra il VI secolo dopo Cristo fino al Quattrocento e, solo per citare i più importanti, dipinti di Agnolo Gaddi, di Benedetto Bonfigli, Bartolomeo Caporali e l’unica opera di Luca Signorelli presente in città, la Pala di S. Onofrio (1484).

Inoltre è possibile effettuare visite guidate che portano alla scoperta di un percorso archeologico che si sviluppa per circa 1 km al di sotto della cattedrale, edificata proprio sopra un terrazzamento della città etrusca, e permette al visitatore di affacciarsi su diverse epoche della città (etrusca, romana, tardoantica, medievale).