Il museo comprende reperti risalenti dai periodi della preistoria fino a quelli greco e romano provenienti da scavi della città e da altri siti della Sicilia.

Il piano terreno è diviso in 3 settori (A-B-C), mentre il corpo centrale è dedicato alla storia del Museo e vi sono presentati brevemente i materiali esposti nei singoli settori.

- settore A, dedicato alla preistoria (Paleolitico superiore-Età del ferro), con un'esposizione di rocce e fossili che testimoniano le varie forme di animale nel Quaternario. Essa è preceduta da una sezione in cui vengono mostrate le caratteristiche geologiche del Mediterraneo e della zona Iblea.

- settore B, dedicato alle colonie greche della Sicilia del periodo ionico e dorico, è possibile identificare l'ubicazione delle colonie greche in Sicilia e le rispettive città di provenienza. Sono inoltre esposte: una statua marmorea di Kouros acefala proveniente da Leontinoi (Lentini) datata agli inizi del V secolo a.C. I reperti della colonia dorica di Megara Hyblaea, statuette votive di Demetra e Kore e una Gorgone, una testa di Augusto proveniente da Centuripe. Inoltre è esposta anche la Venere Anadiomene detta anche Venere Landolina dall'archeologo che la scoprì a Siracusa nel 1804, definita stupenda "per l'eccellenza del modellato.

- settore C sono esposti reperti delle sub-colonie di Siracusa: Akrai (664 a.C.), Kasmenai (644 a.C.), Camarina (598 a.C.), Eloro. Nonché reperti provenienti da altri centri della Sicilia orientale e da Gela ed Agrigento.

- settore D, posto al primo piano, è stato inaugurato nel 2006 e contiene i reperti di epoca ellenistico-romana. Al suo interno sono contenuti alcuni tra i reperti più celebri del museo: la Venere Landolina ed il Sarcofago di Adelfia, oltre ad una selezione di monete provenienti dal gabinetto numismatico di piazza Duomo.