La Galleria nazionale delle Marche ha sede nel Palazzo Ducale e le sue collezioni derivano in larga parte da opere raccolte nel XIX secolo da chiese e conventi del territorio marchigiano.
Passando l'appartamento degli ospiti si arriva all'appartamento del duca Federico. Questa è sicuramente la parte più importante della galleria e dove sono situate le opere più preziose del museo. La sala delle udienze (sala 16) contiene fra l'altro la Flagellazione e la Madonna di Senigallia entrambe di Piero della Francesca.
Più avanti il celebre studiolo del duca Federico (sala 18), compito nel 1476, con pregevoli stucchi sulla volta e rivestito nella fascia inferiore di legno intarsiato da Baccio Pontelli su disegni di Sandro Botticelli, di Francesco di Giorgio Martini e di Donato Bramante. La fascia intermedia tra la volta gli armadi intarsiati conteneva in origine ventotto ritratti di uomini illustri realizzati da Giusto di Gand e Pedro Berruguete. Accanto allo studiolo si trovava la Biblioteca, oggi dispersa.
La sala 20 una volta era la Camera da letto del Duca: bellissime le tarsie delle porte i cui disegni sono attribuiti a Sandro Botticelli (quella con Marte e Ercole) e a Francesco di Giorgio Martini (Rappresentazioni prospettiche di Palazzi). Sempre in questa sala si trova anche l'opera di Pedro Berruguete Ritratto di Federico da Montefeltro col figlio Guidobaldo (1476 - 1477)
Nella sala degli Angeli (sala 21) si può ammirare la celebre Veduta della città ideale, attribuita, tra gli altri, a Luciano Laurana, Piero della Francesca, Francesco di Giorgio Martini e Leon Battista Alberti, del quale sarebbe l'unica prova pittorica. Si trovano nella sala anche altre opere notissime: la Pala del Corpus Domini, composta dalla tavola della Comunione degli Apostoli (1473-1474) di Giusto di Gand e la predella del Miracolo dell'Ostia profanata (1467-1468) di Paolo Uccello.
Nella sala 25 (Salotto della Duchessa) si trovano le due opere di Raffaello conservate nella Galleria: il Ritratto di gentildonna (detto tradizionalmente La Muta) e la piccola Santa Caterina di Alessandria. Nella sala 26 (Camera da letto della Duchessa) si trovano le opere di Tiziano: l'Ultima cena e la Resurrezione.
Salendo al secondo piano si arriva all'appartamento roveresco, così chiamato perché realizzato sotto Guidobaldo della Rovere. Qui sono ubicate opere di Federico Barocci e altri artisti della prima metà del XVII secolo. Tra le altre opere una bellissima Madonna col Bambino e santa Francesca Romana di Orazio Gentileschi (sala 4)
In alcuni ambienti al piano terra è ospitato anche il Museo archeologico urbinate, ricco soprattutto di epigrafi antiche.
