Il percorso espositivo inizia nel vestibolo e prosegue con alcune sale dedicate alla scultura (interessanti i busti dei granduchi, soprattutto di Cosimo I ritratto come un imperatore romano) e al mobilio antico, come la sala degli Staffieri, la Galleria delle Statue e la sala del Castagnoli, oltre la quale a sinistra inizia la galleria vera e propria. Le sale seguenti prendono il nome dal tema degli affreschi che le decorano sulle volte. Il ciclo è dedicato alla mitologia greco-romana, ma celebra anche la dinastia di casa Medici secondo un preciso e articolato sistema simbolico.

In particolare i soggetti mitologici rappresentano degli esempi che alludono al tema della Vita e educazione del Principe, e rappresentano un'opera fondamentale del barocco a Firenze, che produssero profonda influenza sugli artisti locali dal Seicento in poi.

Gli affreschi delle prime cinque sale furono realizzati dal più celebre artista dell'epoca, Pietro da Cortona, mentre le altre sale sono opera di artisti neoclassici della prima metà dell'Ottocento.

La prima apertura al pubblico risale al 1833, con un nucleo eccezionale di opere Raffaello, Andrea del Sarto e Tiziano, nonché tutti i maestri della scuola fiorentina tra Cinque e Seicento, notevoli esempi della scuola veneta coeva ed alcune famose opere di Caravaggio, Rubens e Van Dyck.