La chiesa faceva parte originariamente del grande complesso del convento di San Marco, in cui vissero ed operarono molti fra i più importanti rappresentanti della spiritualità e della cultura quattrocentesca. Dal 1869 l'ex-convento ospita il Museo Nazionale di San Marco, di cui però non fanno parte né la chiesa né l'attiguo chiostro di San Domenico.

Internamente è ad unica navata e presenta numerose cappelle laterali, disegnate nell'ultimo quarto del Cinquecento dal Giambologna (dal 1579) e ornate soprattutto da tavole cinque-seicentesche. Anticamente era coperta da affreschi trecenteschi, dei quali restano tracce ritrovate qua e là sotto gli intonaci. Questi resti suggeriscono un lungo arco di interventi pittorici, collocabili tra il 1380 e il 1420 circa. A Michelozzo competerono la riedificazione della sagrestia e dell'abside. Dal 1679 vennero realizzate la tribuna ed il soffitto intagliato su progetto di Pier Francesco Silvani. La tela al centro del soffitto con l'Assunzione della Vergine e di Giovanni Antonio Pucci (1725).

Il primo altare di destra è decorato dalla pala di Santi di Tito raffigurante San Tommaso in preghiera davanti al crocifisso, del 1593. Nel secondo altare una Madonna e santi di Fra' Bartolomeo (1509 circa), mentre il terzo presenta un grande mosaico della Vergine, che proviene dall'antica basilica di San Pietro in Vaticano: arrivò a Firenze verso il 1596, quando venne realizzato l'altare. Gli angeli e i santi Domenico e Raimondo in adorazione attorno alla Vergine furono aggiunti a Firenze e sono dipinti a imitazione del mosaico, da qualcuno vicino allo stile di Fabrizio Boschi. Il quarto altare presenta la tela di Matteo Rosselli con la Madonna del rosario e angeli che portano in cielo San Domenico (1640), mentre la statua di San Zanobi sull'arco che incornicia l'altare è del Giambologna.

Il primo altare, quello più vicino alla controfacciata, è decorato dal Miracolo di San Vincenzo Ferrer, del Passignano (1593), mentre il secondo dal Matrimonio mistico di Santa Caterina, copia da Fra Bartolomeo di Antonio Domenico Gabbiani (1690). Il terzo altare è ornato dalla tela di Eraclio che porta la croce del Cigoli (1594), ed ai lati sono collocati i due monumenti agli umanisti qui sepolti: Pico della Mirandola e Poliziano.

La cappella Salviati o di Sant'Antonino (a cui si accede solo dal museo), fu progettata dal Giambologna e decorata in larga parte da Alessandro Allori. A quest'ultimo si devono gli affreschi della cupola, la decorazione a grisaille (completati nel 1588) e la pala d'altare con la Discesa al Limbo (commissionata prima del 1584). Le tavole alle pareti laterali sono coeve e rappresentano Gesù che guarisce il lebbroso (a sinistra, del Poppi) e la Vocazione di san Matteo (a destra, di Giovan Battista Naldini).