Nel 1776 il canonico della cattedrale di Volterra Pietro Franceschini rinveniva nei pressi della necropoli etrusca del Portone un ipogeo di notevoli dimensioni risalente all' epoca ellenistica, contenente quaranta urne etrusche, che nel 1777 donò al comune di Volterra. Questa donazione fu il primo nucleo del Museo Civico che in breve tempo raccolse molte altre opere rinvenute nei dintorni di Volterra e che fino a quel momento erano state custodite in collezioni private di nobili volterrani.

Tra le varie donazioni la più importante e più consistente fu quella di Monsignor Mario Guarnacci (1701-1785), un facoltoso sacerdote promotore di numerose campagne di scavo archeologiche, che il 15 settembre 1761 donò la sua intera collezione al neonato museo. A lui venne intitolato il museo che in oltre due secoli di storia ha incrementato il suo patrimonio grazie a numerose campagne di scavo promosse dalla Soprintendenza alle Antichità dell'Etruria.

Prima sede del museo fu palazzo Ruggeri, abitazione del Guarnacci, in seguito venne trasferito prima in alcune sale del municipio e poi dal 1877 nel palazzo Desideri-Tangassi, attuale sede.

Primo Prefetto e Bibliotecario del Museo Guarnacci di cui si ha notizia fu l'abate romano Francesco Ballani, noto librettista del suo tempo, a cui successe nel 1805 Giuseppe Cailli fino alla sua morte nel 1810. Francesco Inghirami (1772-1846) occupò questa carica dal 1810 fino al 1815.