Il nucleo originario del museo è ospitato nella ex-cappella biblioteca del Seminario Girolamo Gavi, ubicato nel cuore della città ottocentesca, nei pressi del Cisternone e del Complesso Gherardesca.

Qui sono conservate diverse opere d'arte di proprietà della Diocesi di Livorno, precedentemente sparse sul territorio, come un ostensorio risalente al 1692 in argento e metallo dorato, pregiate vesti liturgiche realizzate da importanti manifatture attive tra il XVII e XIX secolo, una raccolta di numerosi ex voto e un tabernacolo portatile donato all'inizio del XVII secolo dal granduca Ferdinando I de' Medici per il Duomo cittadino. Tra i dipinti conservati, meritano di essere ricordate due tavole di scuola giottesca, provenienti dalla chiesa di San Jacopo in Acquaviva e depositate in passato presso il Museo nazionale di San Matteo, a Pisa.