Il museo custodisce opere provenienti in gran parte dalle collezioni appartenute alla Fraternita dei Laici, associazione a scopo caritatevole nata nel 1272, e dalla Pinacoteca comunale di Arezzo, con i beni artistici incamerati con le leggi di soppressione dell'Ottocento. L'esposizione si sviluppa su tre piani dell'edificio.

Le due sale al piano terreno custodiscono sculture e frammenti di lapidi di epoca medievale, colonne, capitelli e sculture provenienti dal Duomo e da altre chiese di Arezzo.

Le sale al primo piano sono dedicate all'arte medievale e rinascimentale: sono esposti dipinti due-trecenteschi di Margaritone d'Arezzo, Dietisalvi di Speme, affreschi staccati di Spinello Aretino, la Madonna della Misericordia di Parri di Spinello e due pale di Bartolomeo della Gatta. Nel corridoio è collocato il Convito per le nozze di Ester e Assuero di Giorgio Vasari, uno tra i più grandi dipinti su tavola del Cinquecento italiano, realizzato per il refettorio della Badia delle Sante Flora e Lucilla.

Al secondo piano sono esposti i dipinti dal XVI al XX secolo. Presenti alcune tavole di Luca Signorelli, tra cui la Madonna col Bambino e santi, e l' Allegoria dell'Immacolata Concezione e uno stendardo raffigurante san Rocco, opere di Vasari.

Completano il percorso espositivo le collezioni di maioliche rinascimentali, con alcuni vasi per farmacia provenienti dal Monastero di Camaldoli; presenti anche terrecotte di Andrea della Robbia, raccolte di vetri, coralli e pietre preziose.