Si tratta della prima prova del Ghirlandaio sul tema dell'Ultima Cena, che venne ripetuta poi nel Cenacolo di Ognissanti (1480) e nel Cenacolo di San Marco (1486).

L'opera venne eseguita con la collaborazione del fratello David ed è documentata dal 25 giugno al 1º settembre 1476. I due artisti tornarono una seconda volta alla Badia dal 22 ottobre al 22 dicembre 1477 per affrescare la sala del Capitolo e una terza volta dal 13 maggio al 12 giugno 1478 per dipingere il giardinuzzo, queste ultime due opere perdute.

Il lavori avvennero sotto la direzione dell'abate Isidoro del Sera il quale decise di farvi realizzare un Ultima Cena, secondo le consuetudini monastiche. La parte decorativa venne affidata inizialmente a Bernardo Rosselli che nel 1472 dipinse le due lunette poste sopra il cenacolo, per questo lavoro ricevette una paga di 24 lire. Dei lavori dei Ghirlandaio a Passignano ha scritto anche Giorgio Vasari e nel libro della contabilità del monastero si leggono i compensi percepiti dai due fratelli, ma anche i materiali usati e chi li forniva.