Fu edificato in un punto dove il Tevere penetrava da nord nella città antica di Roma e, fino all'inizio del XX secolo, si trovava in una zona non urbanizzata, mentre oggi è largamente circondato da abitazioni civili e altri manufatti, oltre che da una fitta rete di opere stradali.

Essendo prosecuzione assiale della via Flaminia dalla parte opposta del Tevere, Ponte Milvio era un passaggio obbligato per chiunque lasciasse Roma per dirigersi a nord, sia verso l'Adriatico (Flaminia) che verso la Toscana (proseguendo lungo la Cassia). Inoltre, dalla via Flaminia, si diramavano anche due direttrici minori, la Clodia e la Veientana, che collegavano i possedimenti romani nell'alto-medio Lazio con Roma.

La prima menzione del ponte risale al 207 a.C., in relazione al ritorno dalla battaglia del Metauro nel corso della seconda guerra punica. Il ponte doveva essere a quest'epoca ancora in legno e la sua costruzione deve essere attribuita ad un Molvius (appartenente alla gens Molvia, attestata dalle fonti). Nel 110-109 a.C. il censore Marco Emilio Scauro ricostruì il ponte in muratura.

Fu luogo di importanti avvenimenti storici: vi ebbe luogo l'arresto di Tito Volturcio, da cui Cicerone intercettò le lettere che gli consentirono il giorno dopo di denunciare la congiura di Catilina in Senato. Quattrocento anni dopo, nel 312, nelle campagne gravitanti verso il ponte, ebbe luogo la battaglia tra Costantino I e Massenzio nota come battaglia di Ponte Milvio. Una leggenda riporta che Costantino vide una croce recante la scritta: In hoc signo vinces che lo incoraggiò alla battaglia e alla seguente adozione del cristianesimo come religione ufficiale dell'Impero. Secondo un'altra leggenda, quella croce comparve invece sopra al Monte Musinè in Valle di Susa, sempre nel 312 e sempre in occasione dello scontro tra Costantino e Massenzio, che però avvenne in occasione della Battaglia di Torino.

Del ponte romano restano le tre arcate centrali. Il ponte era stato danneggiato dalle vicende belliche medioevali (vi era stata, inoltre, costruita sull'imboccatura settentrionale una fortificazione di forma triangolare nota come Tripizzone sulla base di una torre difensiva del III secolo), quando era conosciuto come ponte Mollo. Nel 1429 si ebbero i primi restauri sotto papa Martino V e i lavori furono affidati a Francesco di Gennazzano. Nel 1458 furono eliminate delle parti in legno e fu demolita la fortificazione medioevale.