L'Orto Botanico dell'Università di Pisa nacque nel 1543-1544 per iniziativa di Luca Ghini, medico e botanico di Imola, con l'appoggio finanziario del granduca di Toscana, Cosimo I de' Medici.

Come data di fondazione, si tratta del più antico orto botanico universitario del mondo, ma il fatto che la localizzazione originale fosse diversa dall'attuale rende l'Orto botanico di Padova titolare di questo primato: il primitivo orto pisano sorgeva infatti nel giardino annesso al Convento di San Vito, nei pressi della Cittadella e dell'Arsenale mediceo, ed era per l'appunto denominato Giardino dell'Arzinale. Qualche anno più tardi, con la demolizione del suddetto convento, l'orto si estese anche nella zona da esso occupata. Nel 1563, sotto la guida del botanico Andrea Cesalpino, a causa dell'espansione dell'Arsenale l'orto fu trasferito in una seconda sede, nella zona nord-orientale della città, nei pressi dell'Orto del Convento di Santa Marta. Neanche questa sede risultò tuttavia soddisfacente, sia per la cattiva esposizione che per la distanza dalla sede dell'Università.

Così nel 1591 l'Orto, sotto la direzione di Lorenzo Mazzanga, fu trasferito nella attuale localizzazione, presso la celebre Piazza del Duomo, in un terreno acquistato appositamente dal Granduca Ferdinando I. I lavori di trasferimento furono completati nel 1595 ad opera del fiammingo Joseph Goedenhuitze, noto in Italia come Giuseppe Casabona, ed inclusero anche la ristrutturazione dell'edificio che ospitava l'Istituto di Botanica con l'annesso Museo di Scienze Naturali. L'ingresso principale dell'Orto fu aperto nella seconda metà del XVIII secolo.

La disposizione delle piante all'interno dell'Orto, come risulta da una mappa pubblicata da Michelangelo Tilli nel 1723, era ispirata ai canoni stilistici comuni a molti giardini dell'epoca con allusione ai quattro elementi: il quadrato per quelli terrestri, il cerchio per quelli celesti, il triangolo per il fuoco e le vasche per il riferimento diretto all'acqua. Le specie erano infatti collocate in otto grandi aiuole quadrate, a loro volta suddivise in porzioni più piccole di forma geometrica definita, simmetricamente disposte intorno a otto fontane con vasca.