Si devono a Fulgenzio Witman, monaco vallombrosano, l'istituzione della prima cattedra di botanica e l'avvio della progettazione dell'Orto botanico pavese. Nel 1772 il conte Carlo Giuseppe di Firmian, plenipotenziario degli Asburgo per la Lombardia, consigliò di adottare come esempio l'Orto botanico di Padova. Nel 1773 furono, dunque, intrapresi i lavori per la costruzione della sede odierna. Nel 1774 venne insediato il Laboratorio di Chimica. Nel 1777, quando gli edifici dell'Orto presentavano già un assetto simile a quello attuale, assunse la direzione Giovanni Antonio Scopoli. Sotto la direzione di Scopoli l'Orto botanico pavese raggiunse un assetto comparabile a quello dei più famosi orti botanici italiani. La direzione di Scopoli portò, tra i numerosi vantaggi, una fitta corrispondenza con i più grandi orti botanici europei. La riorganizzazione dell'Orto riprese, sotto la direzione di Domenico Nocca (1797-1826) nel 1797. Giovanni Briosi (1883-1919), divenuto direttore dell'Orto, nel 1883 ne migliorò ulteriormente la qualità, aggiungendo tre serre calde. Nel periodo successivo alla seconda guerra mondiale, le scelte non furono più guidate dal principio dell'innovazione, bensì da quello del maggior risparmio economico possibile.

Già sotto la direzione di Scopoli avveniva la raccolta di erbari continuata poi fino alla direzione di Moretti (1826-1853). Da Giuseppe Garovaglio (1853-1882) furono rilevati gli erbari di Giuseppe Comolli e Guglielmo Gasparrini; tali erbari furono ritenuti tanto importanti da essere conservati separatamente dalla collezione generale. Risale alla direzione di Raffaele Ciferri (1942-1964) la costituzione di un erbario lombardo e di un erbario generale, pensati con l'intento di far confluire tutto il materiale presente. Alcuni erbari, ad esempio quello di Adriano Fiori, hanno in parte mantenuto forma autonoma. Da citare, tra le collezioni principali, quella micologica e quella di licheni. Ogni campione è caratterizzato da un'etichetta che reca luogo e data di raccolta del materiale e firma di coloro che l'hanno catalogato.

Degni di nota sono i due grandi gruppi di azalee (Rhododendron indicum) coltivati per scopi estetici all'interno dell'Orto.