L'interno presenta un basamento circolare in pietra e la copertura è stata realizzata mediante una volta emisferica ad anelli concentrici in bicromia (cotto e travertino). Questo tipo di realizzazione è riferibile all'ambito del romanico pisano-lucchese che qui mostra una delle prime manifestazioni in terra senese. La copertura ricorda quella delle tombe etrusche a tholos.

La parete circolare è aperta da quattro monofore asimmetriche a doppia strombatura. Dalla parte opposta all'ingresso si apre il volume semicircolare dell'abside. Al centro si trova il celebre masso nel quale è inserita la spada di San Galgano.

Sulla parte sinistra, rispetto all'ingresso, si trova una cappella dalla pianta rettangolare coperta con una volta a crociera; tale cappella è stata realizzata all'inizio del Trecento e affrescata tra il 1334 e il 1336 da Ambrogio Lorenzetti.

Alla parete di fondo si trova raffigurata la Maestà maestosa. In tale raffigurazione si vede in basso Eva sulle cui spalle si trova una pelle di capra (a simboleggiare la lussuria) mentre con una mano sorregge un fico (simbolo del peccato) e con l'altra mostra un cartiglio dove viene spiegata la morale della scena. La Madonna nella prima raffigurazione aveva nella mano sinistra uno scettro e sulla destra, invece del bambino, un globo (simbolo di potere generalmente riferito ad uomini).

Sulla stessa parete, in basso, si trova un affresco raffigurazione l'Annunciazione con al centro la finestra (vera) della cappella usata dal Lorenzetti quale elemento della raffigurazione. Nella parete sinistra, in alto affresco con Galgano circondato da Santi e Angeli offre un modello della roccia dov'è infissa la spada e nella parte inferiore Veduta di città con figure alate. Nella parete di destra, in altro sinopia di Santi e Angeli (l'affresco è andato parzialmente perduto) e nella volta tondi con raffiguranti dei Profeti.