La posa della prima pietra del duomo avvenne nel 1603, ma poi i lavori proseguirono a rilento, per mancanza di fondi, per i difficili rapporti tra Venezia e lo Stato pontificio e per i diritti sulla giurisdizione ecclesiastica vantati dal patriarcato di Aquileia. Il progetto di partenza fu riadattato ed una seconda "prima pietra" fu posata nel 1615. Emersero poi anche problemi strutturali della facciata, tanto che il tetto con le ampie capriate in legno proveniente dalla Slavonia fu completato nel 1636, anno della consacrazione dello stesso duomo.

La candida facciata, in pietra bianca d'Orsera e pietra grigia di Aurisina, elegantemente divisa su due ordini di quattro semicolonne, è conclusa da un maestoso frontone nel cui oculo centrale campeggia un poderoso leone di san Marco, simbolo della potenza politica e militare della Serenissima Repubblica di Venezia. Il leone che si può vedere oggi è stato realizzato nel 1894 in bronzo, per sostituire quello originario rimosso dai francesi. Verso la fine del XVII secolo sulla facciata furono collocate le statue dei santi protettori di Palmanova: al centro il Redentore (1683), mentre ai lati san Marco e santa Giustina (1693).

Subito dopo il portale d'ingresso, sulla sinistra è presente il grande reliquiario ligneo, opera di Silvio Piccini del 1895, con quattro reliquiari a fanale del XVII secolo. L'altare successivo risale al Seicento e proviene dalla chiesa soppressa di santa Barbara, con la pala che raffigura l'Annunciazione del pittore forlivese Pompeo Randi (1877). Segue il fonte battesimale, in pietra d'Aurisina e risalente al 1614, e l'organo, fatto realizzare dal provveditore Girolamo Dolfin nel 1648, anche se quello che si può vedere oggi è stato completamente rifatto nell'Ottocento. Sotto le casse dell'organo si apre la cappella feriale, dove sono esposti i mosaici di Giulio Candussio, il crocifisso bronzeo del Busetti e, incastonata nell'altare, l'urna di vetro con la statua in cera contenente le reliquie di santa Giustina da Padova. Vicino all'abside sinistro si può notare l'altare delle Milizie, fatto realizzare dalla famiglia Gradenigo tra il 1640 ed il 1680. La pala delle Milizie, posta sopra l'altare, è il capolavoro del 1641 di Alessandro Varotari detto il Padovanino; raffigura i santi Bartolomeo e Girolamo, protettori della famiglia Gradenigo, assieme ai santi guerrieri Teodoro, Barbara e l'arcangelo Gabriele, protettori delle milizie veneziane.