La catacomba è sita nell’antico praedium Domitillae, attestato dalle fonti letterarie antiche e da ritrovamenti epigrafici. Nella famiglia dei Flavi, nel I secolo, esistevano due figure femminili col nome di Flavia Domitilla:

- la prima è la proprietaria del suddetto fondo, moglie del console del 95 Flavio Clemente;
- la seconda è la nipote dello stesso console, venerata come martire nel IV secolo.

La catacomba dunque deve il suo nome ad una delle due Domitilla, della famiglia dei Flavi, convertiti al cristianesimo e per questo perseguitati.

La catacomba si sviluppa soprattutto su due piani, anche se in alcune parti sono stati scavati anche un terzo ed un quarto piano. Si distinguono inoltre sette regioni, tutte di epoca pre-costantiniana.

Dall’attuale ingresso del cimitero si accede alla basilica dedicata a Nereo ed Achilleo, che, dai rinvenimenti epigrafici, è databile fra il 390 ed il 395; la sua edificazione ha portato a sacrificare alcune gallerie e allo sconvolgimento dell’assetto funerario preesistente. Nella zona dell’abside sono stati scoperti i resti del ciborio, edificato sopra la tomba dei martiri, e costituito da resti di due colonnine; in particolare, quella dedicata ad Acilleus (così la scritta dedicatoria) riporta ancora integra la scena del martirio, scolpita nel marmo, che ritrae un personaggio vestito con abiti militari che sta per decapitare un altro personaggio vestito con una lunga tunica; sullo sfondo si vede una corona d’alloro, simbolo del martirio.

Alle spalle della basilica sorse nel IV secolo una nuova regione cimiteriale, ricca di tombe, data la vicinanza del santuario martiriale. Qui si trova l’arcosolio della matrona Veneranda, con la pittura che ritrae la matrona introdotta in paradiso dalla martire Petronilla, riconoscibile dalla didascalia Petronella mart(yr).

Un’altra regione precostantiniana, ed anche una delle più conosciute dell’intera catacomba, è quella denominata ipogeo dei Flavi. Esso nasce nel II secolo, è di carattere familiare ed in origine pagano: è composto da un’ampia galleria, caratterizzata da una ricca decorazione, su cui si aprono lateralmente quattro nicchioni, ove erano posti i sarcofagi dei membri più importanti della famiglia; in fondo vi era la zona per le sepolture dei servi e dei liberti.

Altri importanti monumenti sono il cubicolo di Ampliato e la regione denominata dello scalone del mosaico.