Il Palazzo presenta la connotazione tipologica di dimora patrizia secondo i canoni di villa-fortezza, tipica delle ville laziali tra il ‘500 e il ‘600, come ad esempio Palazzo Farnese a Caprarola.

La facciata si impone per il suo sviluppo orizzontale, si eleva dal fossato per 4 piani e risulta conclusa da due possenti bastioni angolari più bassi, sui quali si innestano due ali posteriori che delimitano una corte retrostante, conferendo al palazzo un impianto ad U. Gli ampliamenti sui bastioni sono stati identificati come opera dell’architetto Troiano Schiratti, così come la realizzazione delle mura di cinta del palazzo lungo la via Clodia, eseguiti a partire dal 1583 fino ai rovesci di fortuna corsi ai Santacroce nel 1599. Il portale d’ingresso, cui si accede dal ponte, porta lo stemma degli Altieri. Il secondo piano è scandito dal loggiato a cinque campate al di sopra del quale è disposto l’attico.

L’area museale si sviluppa sul piano nobile, composto da un grande atrio che immette, tramite un portale sormontato dallo stemma di papa Clemente X Altieri, nel salone centrale a doppia altezza, detto “sala degli Avi”, per i ritratti dei personaggi maggiori della famiglia Altieri. Ad ovest dell’atrio si accede allo scalone affrescato a grottesche e alla “sala del trono”; ad est alla sala detta “sala di Giuseppe” per il tema degli affreschi manieristi. Il bastione di levante ospita l’appartamento del primogenito, Onofrio III Santacroce, cui si deve la valorizzazione del palazzo con i cicli di affreschi tratti dalle storie dell’Antico Testamento attribuiti al pittore tardo-manierista Giovanni Baglione: la “sala del sogno di Giacobbe”, la “sala di Giosuè”  la “sala di Davide”, con la rara rappresentazione dell’arca santa, e  la “sala di Eliseo”. Tale intervento rese il palazzo pari ai maggiori esempi dell’epoca.

Le altre sale ospitano le serie di quadri appartenute agli Altieri: la quadreria “delle Belle”, “degli Avi”, “di Papi, cardinali e principi” e l’originale “Galleria dei Papi” lunga 70 metri, raccolta di tutte le effigi papali ideata dal cardinale Paluzzo Altieri, desunta da quelle esistenti in San Paolo fuori le Mura. “La sala da pranzo”, “la sala delle vedute” e “la sala delle Belle”, sono decorate con tele, stucchi ed arredi di gusto neoclassico dell’architetto Giuseppe Barberi.