Il museo è il frutto della fusione del Museo Civico e Diocesano d’Arte sacra, con la Collezione del Conservatorio di San Pietro, il monastero di San Pietro e il monastero di Santa Caterina e Maddalena, la Collezione Romano Bilenchi e la Collezione di Walter Fusi.

Il percorso si apre con il Tesoro di Galognano, un corredo di oggetti sacri del VI Secolo, che costituisce la prima testimonianza cristiana a Colle; il calice che lo compone, porta inciso l’emblema del Sacro Chiodo, la reliquia assai venerata in città e conservata nel Duomo. Suggestiva la prosecuzione con le pitture religiose di esponenti della scuola senese, fra i quali il Maestro di Badia a Isola e Cennino Cennini; un’influenza che verrà meno a partire dal 1349, quando Colle passò dalla sfera d’influenza senese a quella fiorentina, e anche in campo artistico si respirò un clima nuovo, ravvisabile ad esempio nella ben più scenografiche pale di Giovanni Maria Tolosani (sua l’Adorazione dei Magi del 1522), vicino al Ghirlandaio, mentre Girolamo Genga ricorda il Perugino.

Degna di nota, la galleria dei ritratti dei personaggi illustri di Colle: il busto di Arnolfo di Cambio, quelli di alcuni esponenti della famiglia degli Usimbardi (che espresse il primo vescovo della diocesi e patrocinò il Monastero di San Pietro, sede dell’attuale Museo), e ancora il garibaldino Giuseppe Bordi. Poiché però nel Settecento la città ebbe numerosi benefici da parte del Granduca Leopoldo, in galleria campeggia anche il suo ritratto.

La Galleria Civica, che costituisce la sezione moderna del Museo, accoglie le tele del tardo Macchiaiolo Antonio Salvetti, e l’astrattismo novecentesco di Walter Fusi. Per la cronaca, oltre che artista, Salvetti fu anche esponente politico, ricoprendo la carica di primo sindaco socialista della città fra il 1897 e il 1898. Dalle sue tele, scaturisce la vitale comunità colligiana, presa nei suoi momenti di quotidianità, immersa nella quiete campestre.