Il percorso espositivo di palazzo Borgia si sviluppa in undici sale, lungo il quale le opere d'arte e la suppellettile ecclesiastica, proveniente dal Duomo e dal territorio diocesano, sono esposte secondo un rigoroso criterio cronologico. Vi sono esposte opere di Pietro Lorenzetti, Sano di Pietro, Luca Signorelli, il Vecchietta e altri.

Il capolavoro assoluto del museo è il cosiddetto Piviale di Pio II, opera rarissima sia in Italia che nel mondo , fu donata al papa dal Despota di Morea Tommaso Paleologo e da questi alla Cattedrale pientina nel 1462; risalente al XIII sec. è realizzato con un sistema di ricamo decorativo chiamato opus anglicanum in seta policroma e argento, raffigura entro edicole gotiche scene della vita di Maria, di Santa Margherita di Antiochia e Santa Caterina d'Alessadria, per un totale di oltre 150 figure. Il disegno dell'opera è associato dai critici all'ambiente culturale o alla mano stessa del miniatore della cosiddetta Bibbia di Holkam, conservata al British Museum di Londra.

Un ultimo gioiello legato alla memoria di papa Pio, ma entrato nel museo solo recentemente, è il reliquiario della testa di Sant'Andrea, opera del fiorentino Simone di Giovanni Ghini (1463), donato da papa Paolo VI nel 1964. Questo dono fu fatto in riparazione della perdita del reliquiario bizantino della testa che, donato da Pio II con la mandibola del santo alla Cattedrale di Pienza, fu poi usato per la restituzione della reliquia della testa alla città di Patrasso quale gesto di fraternità di papa Paolo VI alle chiese ortodosse. Il busto qui esposto, fino a quella data ha custodito la testa a Roma nel pilastro di Sant'Andrea nella basilica di San Pietro.