Il Museo raccoglie molte opere d'arte che spaziano dal Medioevo all'Ottocento. Fra queste vanno ricordati alcuni polittici (fra cui quello del Duomo, di Bernardo Daddi) con le Storie della Cintola, di Giovanni da Milano e Lorenzo Monaco, diverse opere di Filippo e Filippino Lippi. Di quest'ultimo è conservato anche il famoso affresco del Tabernacolo del Canto al Mercatale, che si trovava addossato alla casa natale del pittore: gravemente danneggiato durante un bombardamento nel 1944, fu recuperato e incredibilmente restaurato da Leonetto Tintori. Sono presenti inoltre una maiolica policroma dello scultore fiorentino Benedetto Buglioni ed opere di Andrea della Robbia e Benedetto da Maiano.

Nel museo figurano inoltre opere di Luca Signorelli, della bottega di Botticelli e di molti artisti toscani del XVI secolo. Appartenenti al barocco sono presenti opere di scuola romana, napoletana (come uno splendido Noli me tangere di Battistello Caracciolo), varie nature morte del Settecento, e un interessante Annunciazione di Gian Domenico Ferretti.

Da non dimenticare infine i modelli originali in alabastro e gesso del vaianese Lorenzo Bartolini tra cui quella della celebre Fiducia in dio del 1835, conservata al Museo Poldi Pezzoli di Milano.