Il Museo civico, allestito negli anni trenta del XX secolo, è collocato al primo piano del palazzo e conserva numerosi capolavori dell'arte senese.

Le prime quattro sale (dette della Quadreria) espongono opere dei secoli XVI-XVIII, riordinate nel 1985. Sono opere soprattutto senesi, provenienti dalla collezione Spannocchi, tra le quali spicca la sinopia della Madonna col Bambino e santi del Sodoma, proveniente dalla Cappella di Piazza (1537-1539).

La Sala del Risorgimento che espone affreschi e sculture del XIX secolo. Alle pitture a soggetto storico risorgimentale lavorarono esclusivamente artisti toscani, per lo più senesi: Pietro Aldi, Giorgio Bandini, Amos Cassioli, Alessandro Franchi, Cesare Maccari, Gaetano Marinelli e altri. Tra le sculture spiccano lavori di Enea Becheroni, Giovanni Duprè, Emilio Gallori, Arnoldo Prunai, Tito Sarrocchi e altri.

Da qui si accede alla porzione più antica e prestigiosa del palazzo.

La prima di queste sale, detta Sala dei Priori o Sala della Balìa, è divisa in due sezioni da un arco e completamente ricoperta da affreschi. Vi si vedono Sedici Virtù nelle volte, di Martino di Bartolomeo (1408), mentre alle pareti spicca il ciclo sulla Vita di papa Alessandro III, papa senese, dipinti da Spinello Aretino e dal figlio Parri Spinelli (1407). La porta lignea intarsiata è opera di Domenico di Niccolò, mentre il banco ligneo con intagli e intarsi è di Barna di Turino (1410). Dalla porta opposta all'ingresso si accede a una scalinata che porta ai piani superiori.

La Sala dei Cardinali, o Anticamera del Concistoro. Ha le pareti decorate da vari affreschi tre-quattrocenteschi staccati, che provengono da pareti esterne o da altri locali del palazzo. Tra questi spicca i Santi Caterina d'Alessandria, Giovanni e Agostino con un devoto attribuiti ad Ambrogio Lorenzetti e già sul portale d'ingresso alla Sala di Balìa.

Attraverso un pregiato portale marmoreo di Bernardo Rossellino (1448) si passa alla Sala del Concistoro, dove i governanti si riunivano ai tempi della Repubblica. Le imposte lignee del portale, intarsiate, sono opera attribuita a Domenico di Niccolò. Sulle volte, si trovano affreschi allegorici di Domenico Beccafumi dedicati alle Virtù pubbliche e alla loro pratica nell'antichità (eseguiti con interruzioni dal 1529 al 1535). Sopra la porta il Giudizio di Salomone è un affresco attribuito a Luca Giordano.

La sala più grande e più famosa è la Sala del Mappamondo, detta anche Sala del Consiglio, che conserva due grandi affreschi: la Maestà di Simone Martini (1312-1315) e Guidoriccio da Fogliano all'assedio di Montemassi, attribuito tradizionalmente sempre a Simone Martini (1330), ma molto probabilmente un rifacimento quattrocentesco di un capolavoro perduto del maestro senese. Sotto di essa si trova l'affresco della Presa di un castello (forse di Giuncarico), opera attribuita non concordemente a Duccio di Buoninsegna, datata 1314, che ne fa la più antica decorazione sicura del palazzo.

Sotto venne applicato successivamente da Ambrogio Lorenzetti il mappamondo girevole che diede nome alla sala, ormai perduto, anche se le impronte del suo andamento girevole sono ancora visibili sulla parete.

Sulla parete delle arcate, in alto, si vedono due grandi affreschi a monocromo sulle glorie militari di Siena: a sinistra la Vittoria dei senesi nella battaglia di Val di Chiana, di Lippo di Vanni (1363) e a destra la Vittoria dei senesi sui fiorentini al Poggio Imperiale di Poggibonsi (avvenuta nei pressi di Poggibonsi l'8 settembre 1479) di Giovanni di Cristofano e Francesco d'Andrea (1480). Completano la decorazione della sala una galleria dei più venerati santi senesi sui pilastri, da destra: i Beati Andrea Gallerani e Anbrogio Sansedoini, di autore cnquecentesco, Santa Caterina da Siena del Vecchietta (1460), San Bernardino di Sano di Pietro (1450), il Beato Bernardo Tolomei, fondatore degli Olivetani, del Sodoma (1533), Sant'Ansano e San Vittore del Sodoma (1530 circa).