Il Museo, disposto in 28 sale, è situato nei piani superiori del palazzo apostolico e conserva il Tesoro della Santa Casa, dipinti, sculture, arazzi e maioliche, oggetti d'oreficeria e mobili provenienti dal santuario e donati alla Santa Casa nel corso dei secoli.

Nella raccolta dei dipinti spiccano le otto opere della tarda maturità di Lorenzo Lotto, quasi tutte datate e dipinte fra il 1549 e il 1556: Battesimo di Cristo, Cristo e l'adultera, i Santi Rocco, Cristoforo e Sebastiano (1531), San Michele caccia Lucifero, Adorazione dei Magi, Adorazione del bambino, Sacrificio di Melchisedec e fra tutti l'estrema Presentazione al tempio. Il pittore si trasferì definitivamente a Loreto nel 1554 e vi morì nel 1556 circa nell'assoluto silenzio.

Degne di nota sono gli oltre 500 pezzi di ceramiche da farmacia rinascimentali, in parte provenienti dalla bottega urbinate di Orazio Fontana e donate al santuario dal cardinale Giulio Della Rovere. Di eccezionale valore sono i dieci arazzi tessuti a Bruxelles su cartoni di Raffaello. Fra le opere di alta oreficeria, è il prezioso crocefisso in argento modellato dal Giambologna donato da Cristina di Lorena nel 1573.