Il Museo di San Francesco è ospitato nella sacrestia e nel piano superiore dell'edificio, originariamente dormitorio dei minori. Qui si conservano vari dipinti su tela: Circoncisione (1586) e Martirio di Santa Caterina (1582-84) di Giorgio Picchi; Annunciazione, Transito della Vergine e Madonna di Loreto, tele di scuola locale del XVII secolo; Battesimo di Gesù (1612), di Claudio Ridolfi; Immacolata, un santo e angeli (circa 1630) e Madonna col Bambino e santi (circa 1630), attribuiti a Giovan Francesco Guerrieri; Martirio di San Bartolomeo (circa 1615), di Giovan Giacomo Pandolfi; Incoronazione della Vergine e santi (1574), di Giovan Battista Clarici.
Pregevolissimi i dipinti su tavola: Madonna col Bambino e Sant'Antonio abate (XIV secolo), di Luca di Tommè; Madonna in trono col Bambino (XIII secolo), tavola firmata del toscano Bonaventura di Michele; Madonna col Bambino e San Giovannino (XVI secolo), copia da Girolamo Genga. A questi si affiancano opere ad imitazione realizzate nel 1918 dall'aretino Gualtiero De Bacci Venuti. Numerosi anche gli affreschi staccati: dalla chiesa di Santa Croce, Crocifissione (1373), di Giovanni Brelli; dalla chiesa di San Francesco, Incoronazione della Vergine (XIV secolo), di scuola locale; dalla chiesa di San Michele, Sant'Agostino (XVI secolo), di scuola locale; dalla Pieve Collegiata, Madonna col Bambino (XIV secolo), di scuola marchigiana, e Madonna col Bambino (XV secolo), di scuola umbra.
Si segnalano infine: SS. Pietro e Paolo, sculture in legno intagliato e dorato della scuola di Antonio Bencivenni (XV secolo); Tabernacolo (XVI secolo), in legno intagliato, dorato e dipinto, di scuola locale; vetrata con San Francesco (XIV secolo), adattata nel 1912 da Francesco Mossmeyer; Santa Croce a reliquiario, di bottega toscana (XV secolo); Croci astili (XIV-XVI secolo); Osculatorio con Pace (XV secolo) in avorio intagliato; due medaglioni in marmo (1474), di arte toscana, con le figure di Federico, duca di Urbino, ed Ottaviano Ubaldini della Carda, conte di Mercatello, entrambi attribuiti a Benedetto da Maiano o Francesco di Giorgio Martini.
