Il Museo, disposto in 28 sale, è situato nei piani superiori del palazzo apostolico e conserva il Tesoro della Santa Casa, dipinti, sculture, arazzi e maioliche, oggetti d'oreficeria e mobili provenienti dal santuario e donati alla Santa Casa nel corso dei secoli.
Nella raccolta dei dipinti spiccano le otto opere della tarda maturità di Lorenzo Lotto, quasi tutte datate e dipinte fra il 1549 e il 1556: Battesimo di Cristo, Cristo e l'adultera, i Santi Rocco, Cristoforo e Sebastiano (1531), San Michele caccia Lucifero, Adorazione dei Magi, Adorazione del bambino, Sacrificio di Melchisedec e fra tutti l'estrema Presentazione al tempio. Il pittore si trasferì definitivamente a Loreto nel 1554 e vi morì nel 1556 circa nell'assoluto silenzio.
Sono presenti anche affreschi staccati di Pellegrino Tibaldi che ornavano in passato la cappella di San Giovanni Battista, oggi Cappella dell’Assunta.
Degne di nota sono gli oltre 500 pezzi di ceramiche da farmacia rinascimentali, in parte provenienti dalla bottega urbinate di Orazio Fontana e donate al santuario dal cardinale Giulio Della Rovere. Di eccezionale valore sono i dieci arazzi tessuti a Bruxelles su cartoni di Raffaello. Fra le opere di alta oreficeria, è il prezioso crocefisso in argento modellato dal Giambologna donato da Cristina di Lorena nel 1573.