La chiesa venne costruita per disposizione di Federico da Montefeltro dopo la sua morte, a partire dal 1482 al 1491 circa, come luogo per la sua sepoltura e per quella dei suoi successori (Mausoleo Ducale). Il progetto e la successiva realizzazione dell'opera vengono oggi attribuiti all'architetto ducale Francesco di Giorgio Martini (con l'aiuto nella direzione dei lavori del giovane e promettente Donato Bramante). L'edificio presenta una limpida nitidezza architettonica, tipica del Rinascimento urbinate.

Nella navata si trovano, uno di fronte all'altro, i cenotafi dei duchi Federico e Guidobaldo da Montefeltro: si tratta di due monumenti barocchi eretti molto tempo dopo la loro morte (1620). I busti in marmo dei due duchi sono attribuiti a Girolamo Campagna.

La nicchia destra è decorata da affreschi del 1642 con la Samaritana al pozzo. Nel coro si trova una tela ottocentesca con la Madonna col Bambino, san Bernardino, san Giacomo e due angeli, di Filippo Bigioli. Fino al 1810 occupava questa posizione la Pala di Brera (1472 circa) di Piero della Francesca, che venne fatta li collocare dal Bramante per volere dello stesso Federico da Montefeltro e, sebbene sia più antica della chiesa di circa dieci anni, creava un rilevante dialogo tra architettura reale ed architettura dipinta.