Costruita su istanza del duca Guglielmo Gonzaga e su progetto dell'architetto mantovano Giovan Battista Bertani, l'opera fu edificata in due fasi, dal 1562 al 1567 e dal 1569 al 1572, e dal 1565 le cerimonie religiose di corte vennero dirette dagli innumerevoli abati.

Santa Barbara può essere considerata il capolavoro sia del committente sia dell'artefice; dotata dal duca di numerosi privilegi, dell'esenzione dal controllo vescovile e della possibilità di fregiarsi di un rito proprio, diverso da quello romano, fu pensata come sede delle fastose cerimonie liturgiche corredate da musiche sacre di altissimo livello, la vera passione del duca.

Nella basilica si trova un pregevole organo Antegnati, costruito nel 1565 dall'organaro Graziadio Antegnati e ripristinato durante un accurato restauro nel 1995 - 2006 da Giorgio Carli di Pescantina. Lo strumento, a tastiera unica e pedaliera a leggio di 17 note costantemente unita alla tastiera, è chiuso in una cassa dorata riccamente intagliata collocata sopra la cantoria in cornu Epistulae. Le canne sono chiuse da due portelle, attribuite a Fermo Ghisoni e raffiguranti sulla parte esterna santa Barbara e san Pietro, su quella interna l'Annunciazione.