L'interno è in stile gotico a unica navata, e il soffitto è a volta a crociera decorato con affreschi floreali. Appena entrati si rimane colpiti dalla ricchezza delle pareti e da un coccodrillo impagliato che penzola dal soffitto, collocato nel Santuario nel XV o nel XVI secolo.

L'elemento più originale, strano ed affascinante del Santuario, è sicuramente l'impalcato ligneo che ne orna a doppia loggia le pareti. Unico al mondo, esso fu ideato dal frate francescano Francesco da Acquanegra nel 1517. Si compone di colonne su cui spiccano innumerevoli ex-voto anatomici in cera (mani, occhi, seni) in segno di guarigioni miracolose, e di nicchie in cui trovano posto statue polimateriche (legno, stoffa e cartapesta) di pellegrini umili o famosi imploranti grazie o testimoni di grazie ricevute. Diverse nicchie erano occupate da armature antiche e preziose, ora custodite nel Museo Diocesano di Mantova.

La ricchezza della chiesa non si esaurisce con l'opulenza delle sue decorazioni parietali ma comprende le prestigiose cappelle ai lati dell'unica grande navata: la prima cappella a destra, entrando dal grande portone di legno scuro, è quella di San Bonaventura con il mausoleo dedicato a Baldassarre Castiglione e alla moglie Ippolita Torelli, progettato da Giulio Romano, e il mausoleo del figlio Camillo Castiglione.

La Cappella di San Gabriele, in antichità appartenente agli Strozzi di Firenze e decorata con affreschi del Pordenone, fu restaurata dai frati Passionisti che la intitolarono al loro protettore. Le lunette alla base della volta illustrano la sua vita, mentre a sinistra dell'altare è rappresentato San Paolo della Croce, fondatore dell'Ordine. La pala d'altare raffigura la Madonna col Bambino, opera di Carlo Santner. Il pavimento è in mosaico.

Proseguendo lungo la parete di destra si incontra la cappella della famiglia Bertazzolo con l'opera di Lorenzo Costa il Giovane Il martirio di S. Lorenzo e la cappella Aliprandi che conserva l'icona lignea composta da una statua di Madonna con Bambino e da pannelli rappresentanti Dio Padre e le sante Elisabetta, Caterina, Anna e Apollonia, opere dell'intagliatore Giovanni Battista Viani e di suo fratello, il pittore Antonio Maria Viani.

Sul lato sinistro, nella cappella degli Zimbramonti, di notevole importanza è la pala di San Sebastiano realizzata da Francesco Bonsignori. Gli affreschi delle pareti laterali della cappella sono invece opera di un discepolo di Giulio Romano, Rinaldo Mantovano.