Il museo ospita un eclettico insieme di più di 3600 opere, tra pitture, sculture, armature, strumenti musicali, ceramiche, monete, medaglie e mobili antichi. Fra le opere più importanti, la Carità di Tino di Camaino, la Madonna dei Cordai di Donatello e una Madonna col Bambino attribuita allo stesso artista, terrecotte invetriate della bottega dei Della Robbia, il San Michele Arcangelo di Antonio del Pollaiolo, il Martirio di una santa di Tintoretto, un'opera di Guercino e trenta disegni di Tiepolo.

Due sale al pian terreno sono state dedicate a Firenze ed alla sua storia, con alcune opere emblematiche provenienti dalle strade della città: il Cinghiale di Pietro Tacca dalla fontana del Porcellino, il Diavolino del Giambologna dall'incrocio tra via dei Vecchietti e via Strozzi, il Marzocco dorato dall'architrave di Palazzo Vecchio (tutte queste opere sono sostituite da molti anni da copie in loco e finora sparse in vari musei statali e comunali). Al piano terra inoltre si trova la collezione delle sculture e la sala d'armi.

La sala del piano ammezzato è dominata da un grande Crocifisso ligneo medievale, con la collezione di cassoni nuziali e una vetrina di ceramiche sulla parete. Lungo lo scalone sono stati appesi i tappeti antichi, tra i quali quello di 7,50 metri, che venne usato in occasione della visita di Hitler a Firenze del 1938.

Al secondo e terzo piano si trovano i dipinti, i bronzi e il restauro "in diretta" del Cristo dipinto su una croce lignea sagomata di scuola giottesca. Tra i dipinti, Ercole al bivio di Domenico Beccafumi.